2型糖尿病是一种以血糖和胰岛素抵抗指数明显升高的一类代谢性疾病，近年来随着人们生活方式和饮食习惯改变，2型糖尿病的发病率逐年升高[1]。西医认为，糖尿病的发生与日常生活高脂高糖饮食摄入增加造成胰腺代谢负担加重，同时伴有胰岛素受体不敏感有关，其核心为糖脂代谢异常和胰岛素抵抗升高[2]。目前临床治疗该病的药物主要有磺酰脲类、双胍类、α糖苷酶抑制剂及胰岛素等[3-5]。

中医学认为本病属消渴，治疗本病主要为中药汤剂类，但中医药治疗药理成分不明确，因此采用现代医学思维结合我国古典医学治疗本病是当前的一个研究热点。玉米须为禾本科植物属的花柱和花头，全国大部分地区均有生产，古典医学认为，玉米须归膀胱、肝、胆经，具有清肝利胆的功效[6]。玉米须总皂苷为玉米须中有效成分之一，已有研究将其用于治疗2型糖尿病，但关于其是否可改善糖尿病脂代谢报道较少。本研究采用高脂高糖饮食+链脲佐菌素(STZ)法诱导建立2型糖尿病大鼠模型，观察玉米须总皂苷对血脂是否有调节作用，并分析其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物和饲养条件 雄性SD大鼠60只，体重180 g～220 g，均购于华中科技大学同济医学院动物实验中心，大鼠合格证号SCXK(鄂)2010-0004；饲养环境标准饲养房室温18 ℃～26 ℃，相对湿度55%～65%，每日给予光照12 h。

1.1.2 饲料 标准饲料和高脂饲料均购于华中科技大学同济医学院实验动物中心，其中高脂饲料为88%的基础饲料，10%的猪油，1.5%的胆固醇及0.5%的胆盐。

1.1.3 试剂盒和抗体 玉米须总皂苷由华中科技大学同济医学院药学院提供，纯度为98%；胰岛素检测试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司；脂肪染色试剂盒购于上海榕柏生物技术有限公司；丙二醛(MDA)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)试剂盒购于南京生物工程研究所。STZ购于上海前尘生物科技有限公司；细胞色素P4502E1多克隆抗体和β-actin单克隆抗体购于美国Santa公司，相应二抗购于北京中山金桥公司，引物由上海生物生工设计并制作。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及处理 大鼠均于适应性喂养1周后随机分为空白组、2型糖尿病组(模型组)和玉米须总皂苷治疗组(治疗组)，每组20只(由于本造模方法大鼠死亡率较高，因此造模时实际每组为30只，保证造模死亡过程中每组分到20只)。空白组给予普通饲料喂养和自由饮水，治疗时给予1 mL/(kg·d)；模型组给予高脂饲料和水自由饮用，4周后给予一次性注射STZ 50 mg/kg构建2型糖尿病大鼠模型，治疗时给予1 mL/(kg·d)生理盐水；治疗组给予高脂饲料和水自由饮用，4周后一次性注射STZ50 mg/kg构建2型糖尿病大鼠模型，治疗时给予4 mL/(kg·d)玉米须总皂苷。分别于治疗4周和8周后处死大鼠各半，观察相关生化指标和P4502E1的表达。

1.2.2 标本采集 处死大鼠时隔夜禁食禁水12 h，12 h后以2%的水合氯醛6 mL/(kg·d)腹腔麻醉，之后沿腹中线剖腹，迅速掏出肝脏后，下腔静脉取血即可，将肝左叶取出后置于4%中性甲醛保存备用，血液使用低温离心机4 000 r/min离心后，收集上清液置于超低温冰箱中保存备用。

1.2.3 观察项目

1.2.3.1 血清指标观察 血清氧化和抗氧化能力指标SOD、MDA及GSH，血脂TG和TC，血糖和胰岛素含量均采用相应试剂盒检测，检测方法严格按照说明书进行。

1.2.3.2 光镜观察 HE染色：从中性甲醛溶液中取出肝脏组织，使用梯度乙醇脱水，采用二甲苯固定，石蜡包埋，之后采用切片机将其切成30 μm～50 μm薄片，染色即可。脂肪染色：采用冰冻切片机切取，切取后滴入苏丹Ⅲ染料，充分孵育20 min～30 min后，采用70%乙醇吸取未着色部分，之后再用水冲洗3次，最后再用Mayer氏改良苏木素浅染胞核5 min，1%盐酸乙醇分化，水洗至胞核显蓝色滴入封片剂封固即可(脂肪呈橙红或鲜红色)。

1.2.3.3 Western blot法 总蛋白提取液提取总蛋白后，每组各取60 μg以10%的SDS-PAGE凝胶电泳分离。电泳完成后立即转移蛋白到PVDF膜，转移完成后用3%脱脂牛奶封闭2 h，完成后加入相应1抗(1∶2 000)封闭袋中摇床1 h，之后至于4 ℃冰箱中过夜孵育；次日，洗涤3次后，加入相应二抗(1∶5 000)孵育2 h、洗涤3次后，立即进行化学发光法曝光，之后压片。凝胶图像分析系统检测蛋白质印迹条带灰度，每组实验重复3次。

1.2.3.4 RT-PCR 采用天根总RNA提取试剂盒提取总RNA，提取完成后取2 μg RNA逆转录，逆转率后扩增，扩增条件为：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共33个循环；最后给予72 ℃总延伸5 min。引物序列设计为：4502E1为5-CCTGATATATGGGTTTGC-3，5-GCCAACGGGCCTGTTGTATTAC-3，引物长度为212 bp；β-actin为5-CATCCTGCGTCTGGACCT-3，5-CGGACTCATCGTACTCCTGCT-3，引物长度为595 bp；完后每组各取5 μL PCR产物，0.5%琼脂糖电泳，电泳完成后，凝胶成像仪采集图像，Image J计算每个条带荧光强度值，每组实验重复3次。

1.3 统计学处理 所有数据均采用SPSS19.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，采用t检验；多样本均数采用方差分析(ANOVA)。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 实验大鼠一般情况 空白组大鼠毛发顺畅，饮水和饮食正常；模型组有明显消瘦症状出现，饮食和饮水相较于空白组明显增加，同时毛色发黄；治疗组在治疗4周后相较模型组饮食和饮水量有一定程度降低，治疗8周后饮食和饮水量未进一步增加。

2.2 3组大鼠血清SOD、MDA和GSH含量比较 与空白组比较，模型组SOD和GSH明显降低(P<0.05)，MDA明显升高(P<0.05)；治疗组治疗4周后，SOD和GSH明显升高(P<0.05)，MDA含量明显降低(P<0.05)；治疗8周后SOD和GSH进一步升高(P<0.05)，MDA含量进一步降低(P<0.05)。详见表1。

表1 3组大鼠血清SOD、MDA和GSH含量比较 (±s)

2.3 3组大鼠血糖和胰岛素水平比较 与空白组比较，模型组血糖明显升高(P<0.05)，胰岛素水平明显降低(P<0.05)；治疗组治疗4周后，血糖含量明显降低(P<0.05)，胰岛素水平明显升高(P<0.05)；治疗8周后治疗组血糖进一步降低(P<0.05)，胰岛素水平进一步升高(P<0.05)。详见表2。

2.4 3组大鼠TG和TC水平比较 与空白组比较，模型组TG和TC明显升高(P<0.05)；治疗组治疗4周后TG和TC均明显下降(P<0.05)，治疗8周后治疗组TG和TC进一步降低(P<0.05)。详见表3。

表2 3组大鼠血糖和胰岛素水平比较 (±s)

表3 3组大鼠TG和TC水平比较 (±s) mmol/L

2.5 肝脏脂代谢病理学检测 切片经HE染色可见，空白组细胞排列均匀，无任何脂肪空泡和脂肪变性；模型组有明显肝脏细胞肿胀，同时细胞可见大量脂肪空泡；治疗4周后，其脂肪空泡明显减少，治疗8周后，只有极少数的脂肪空泡。详见图1。脂肪染色可见，空白组大鼠几乎无任何脂肪颗粒；模型组大鼠有明显脂肪颗粒；治疗4周后，治疗组其脂肪分布明显较少，治疗8周后进一步减少，仍有一定的脂肪存在。详见图2。

A为治疗4周后空白组；B为治疗4周后模型组；C为治疗4周后治疗组；D为治疗8周后空白组；E为治疗8周后模型组；F为治疗8周后治疗组。

图1 大鼠肝脏组织HE染色

A为治疗4周后空白组；B为治疗4周后模型组；C为治疗4周后治疗组；D为治疗8周后空白组；E为治疗8周后模型组；F为治疗8周后治疗组。

图2 大鼠肝脏组织脂肪染色

2.6 3组大鼠P4502E1蛋白和mRNA表达比较 与空白组比较，模型组细胞色素P4502E1蛋白和mRNA表达明显升高(P<0.05)；治疗4周后，治疗组其含量明显降低(P<0.05)，治疗8周后进一步下降(P<0.05)。详见图3、图4和表4。

3 讨 论

2型糖尿病脂代谢异常是造成2型糖尿病并发症的危害之一，特别是2型糖尿病并发动脉硬化[7]。有研究报道，2型糖尿病动脉硬化发病率是普通人群的2倍～4倍[8]，因此关注和研究2型糖尿病脂代谢具有重要意义。糖尿病血脂异常主要包括脂代谢数量和质量的异常，包括高TG血症和高胆固醇血症两个重要方面，高胆固醇通过严格控制摄入可良好控制，但高TG血症调控较难，主要由于TG生成除摄入外，自我调节和合成也是重要的一面，特别是肝脏，肝脏细胞是胰岛素受体分泌较多的器官之一。血糖升高后，造成胰岛素抵抗指数增加，胰岛素抵抗指数增加可造成游离脂肪酸流入肝脏增多，最终造成极低密度脂蛋白(VLDL)的过度合成，VLDL过高造成机体清除TG发生障碍，最终造成高TG血症的发生[9-13]。TG增加导致肝脏脂质聚积，最终造成脂肪肝的发生，其也会造成血液TG增加，是引起病人动脉硬化甚至冠心病的发生[14]。

除血脂代谢异常外，机体氧化和抗氧化能力失衡是造成糖尿病发生和发展的重要因素，氧是生物体供能的主要来源,同时也是合成激素、三磷酸腺苷及其他一些重要生理活性物质。糖尿病病人由于自身体质的原因，需要更多的抗氧化物才能降低其并发症发生的概率，机体利用氧进行氧化反应时，氧自身也发生还原反应，进而生成活性氧代谢产物[15-17]。这些氧代谢产物本身有不配对离子、电子、分子或基团，主要包括超氧阴离子自由基(O2-)、过氧化氢(H2O2)及氢过氧化物等。糖尿病病人自身体质较差，其本身有较弱的清除机体糖基化产物和糖氧化产物(MDA等)降低的现象，上述自由基反应明显增强，可造成GSH破坏，产生恶性循环，加重胰岛素抵抗，这也是造成病人发生糖尿病血管并发症的重要因素之一[18-20]。

古代有中医专家采用玉米须治疗糖尿病的研究，近年来随着分子生物学和细胞生物学发展，进一步证实玉米须作用。药学研究发现，玉米须总皂苷和玉米须多糖均有一定的降脂作用，发挥主要作用的为玉米须总皂苷。鉴于非酒精性脂肪肝病的危害[21-23]，本研究采用玉米须总皂苷治疗2型糖尿病大鼠，治疗4周后和治疗8周后处死大鼠，结果显示，治疗组2型糖尿病大鼠血糖和胰岛素含量明显降低，也对肝脏脂代谢有较好的调节作用，其对降低TG和TC具有明显的调节作用。CYP2E1蛋白属于细胞色素P450家族蛋白，P450家族蛋白主要由肝脏细胞分泌，其可在多种病理生理条件下激活发挥作用。由于糖尿病对肝脏的损害是由肝小叶中心区域开始，之后损害整个肝脏， CYP2E1表达基因主要富集于肝小叶中心区域，因此其与脂肪肝的发生有密切关系[24-25]。CYP2E1主要从两方面发挥作用，一方面通过激活活化氧，促进脂质过氧化；另一方面为激活还原型辅酶Ⅱ(NADPH)-细胞色素P450还原酶、将NADPH和NADH电子传递至亚铁血红素，将三价铁还原成亚铁，产生活性更强的羟基自由基，最终造成肝脏调节脂代谢能力进一步降低[26]。本研究结果显示，与空白组比较，模型组细胞色素P4502E1明显升高，提示高脂高糖饮食+STZ建立的2型糖尿病大鼠肝脏有明显w-氧化代谢异常，同时肝脏组织细胞色素P4502E1的表达明显降低，提示玉米须总皂苷可明显降低2型糖尿病大鼠w-氧化。

综上所述，玉米须总皂苷对高脂饮食加STZ诱导的2型糖尿病大鼠脂代谢有明显的调节作用，这可能与其可降低血糖、提高抗氧化能力，抑制CYP2E1的表达有关。

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