代谢组学是在总体的层面上检测物质内部小分子组合的一种方法，从代谢产物的类别、数量和变化的规律方面开展研究[1]。随着人们生活方式的转变以及社会心理因素在疾病发展中的作用逐渐增强，心肌梗死的发病率越来越高[2]。在临床上，心肌梗死发病比较急重，很多病人在早期没有明显的临床征兆，现在临床上常用的监测指标也只是在疾病发作时的心肌损伤标志物，即在发作的时候，心肌已经造成了一定程度的损伤。所以早期、正确的治疗对降低心肌梗死死亡率有重要意义，寻找新的特异性高灵敏的诊断指标和方法显得尤为迫切。目前针对心肌损伤标志物的检测大部分从血液中的蛋白标志等方面来进行探索，本研究从代谢组学的层面对急性心肌梗死病人尿液中所有的代谢产物进行鉴定，然后寻找其具有差别性的部分，利用公开发表的多项研究数据从系统生物学的角度对尿液中心肌梗死的标志物进行研究。
1 资料与方法
1.1 文献检索 从中国知网、万方数据库、维普数据库、Embase、PubMed数据库中检索自数据库建库至2017年2月大鼠心肌梗死的实验研究。 Embase检索式(‘metabolomics′/exp OR‘Metabolome’/exp)AND ‘myocardial infarction’exp。PubMed检索式(metabolomics OR Metabolome)AND myocardial infarction。中国知网检索式：主题=(心肌梗死或者心梗)并且主题=代谢组。万方数据库检索式：(心肌梗死 or 心梗) and 代谢组。维普数据库检索式(心肌梗死 or 心梗) and 代谢组。中国生物医学文献数据库检索式：(心肌梗死 or 心梗)and 代谢组。
1.2 文献纳入与排除标准 ①纳入文献形式包括期刊论著、学位论文、会议论文及会议摘要，排除综述、个案报道、回信书籍及社论等；②纳入文献需包括能提供足够信息的摘要，或可以获取全文资料，排除无法获取摘要的文献；③排除其他物种心肌梗死代谢组学研究及大鼠心肌梗死模型的组织、血清代谢组学研究；④排除与大鼠心肌梗死相关的非代谢组学小分子化合物研究；⑤排除重复文献，不同数据库来源中作者、题目及出版年相同的文献按1篇统计。
1.3 代谢组学中化合物的确定 对纳入文献所研究代谢产物进行统计，汇总所有文献中的代谢产物。对于研究中没有确定的产物暂不收录。代谢产物名称标准化使用metPA网站转换工具，针对此工具未能识别的基因则通过在HMDB、PubChem和KEGG数据库内手工逐一检索其官方名。
1.4 大鼠心肌梗死血清代谢生物信息学分析 信号通路分析采用KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)，代谢产物分子注释、相关的酶或转运蛋白及其相关性质分析采用HMDB(http://www.hmdb.ca/)，代谢产物路径可视化采用metPA网络软件(metpa.metabolomics.ca/)。
2 结 果
2.1 文献检索情况 共检索到文献17篇，其中Embase 2篇，PubMed 2篇，中国知网4篇，万方数据库7篇，维普数据库2篇，排出重复收录文献和相同数据文献，最后有2项研究被纳入[3-4]，均为中文文献。纳入研究文献特征见表1。
表1 大鼠心肌梗死模型文献基本特征
研究大鼠种类及造模方法代谢组学检测方法 代谢产物梁晓萍2011[3]雄性SD大鼠结扎左冠状动脉前降支建立心肌梗死模型UPLC- MS methodHippuric acid,glucose-1-phosphate,citric acid,6-phos-phogluconate,oxalosuccinic acid,N-Acetylserotonin,Phe-nyl phosphate,Nonadecanoic acid,Urobilinogen,N-Acetylglutamate,L-Glutathione谭光国2012[4]雄性SD大鼠结扎左冠状动脉前降支建立心肌梗死模型1H NMRmethodLactate,L-alanine,Succinate,2-oxoglutarate,Citrate,CreatineGlycine,L-tryptophan,Hippuric acidN-methylni-cotinamide谭光国2012[4]雄性SD大鼠结扎左冠状动脉前降支建立心肌梗死模型UHPLC-MS methodCreatine,Uridine,Citrate,L-proline,N-methyl-4-pyri-done-3-carboxamide,N-methyl-2-pyridone-5-carbox-amide,L-isoleucine,Oxalosuccinate,L-tryptophan,Hipp-uric acid,Cyclic AMP,Phenylacetylglycine,N2-Succinyl-L-ornithine,Xanthosine
2.2 代谢产物的确定 纳入的2项研究从大鼠尿液角度对产物进行了分析。汇总各研究的代谢产物，收集的代谢产物中重复出现的按1次计算，总共30个，分别是Xanthosine、urobilinogen、Uridine、Succinate、Phenylacetylglycine、Phenyl phosphate、oxalosuccinic acid、Oxalosuccinate、Nonadecanoic acid、N-methylnicotinamide、N-Acetylserotonin、N-Acetylglutamate、N2-Succinyl-L-ornithine、L-tryptophan、L-proline、L-isoleucine、L-Glutathione、L-alanine、Lactate、Hippuric acid、Glycine、glucose-1-phosphate、Cyclic AMP、Creatine、citric acid、Citrate、6-phosphogluconate、2-oxoglutarate、N-methyl-4-pyridone-3-carboxamide、N-methyl-2-pyridone-5-carboxamide。
2.3 代谢组产物通路检索与匹配情况 对研究中重复出现的30种代谢产物在HMDB、PubChem和KEGG中检索，相应的ID号及基本情况见表2。
表2 大鼠心肌梗死代谢组产物基本情况
序号通用名称数据库中的名称HMDB IDPubChem IDKEGG ID1XanthosineXanthosineHMDB0029964959C01762 2urobilinogenD-UrobilinogenHMDB04158440784C057913UridineUridineHMDB002966029C002994SuccinateSuccinic acidHMDB002541110C000425PhenylacetylglycinePhenylacetylglycineHMDB0082168144C055986Phenyl phosphatePropanoyl phosphateHMDB0839952923231C001577oxalosuccinic acidOxalosuccinic acidHMDB03974972C053798OxalosuccinateOxalosuccinic acidHMDB03974972C05379Nonadecanoic acidNonadecanoic acidHMDB0077212591C1653510N-methylnicotinamideN-MethylnicotinamideHMDB031526495011N-AcetylserotoninN-AcetylserotoninHMDB01238903C0097812N-AcetylglutamateN-Acetylglutamic acidHMDB01138185C0062413N2-Succinyl-L-ornithineN2-Succinyl-L-ornithineHMDB01199127370C0341514L-tryptophanL-TryptophanHMDB009296305C0007815L-prolineL-ProlineHMDB00162145742C0014816L-isoleucineL-IsoleucineHMDB001726306C0040717L-GlutathioneGlutathioneHMDB00125124886C0005118L-alanineL-AlanineHMDB001615950C0004119LactateL-Lactic acidHMDB00190107689C0018620Hippuric acidHippuric acidHMDB00714464C0158621GlycineGlycineHMDB00123750C0003722glucose-1-phosphateGlucose 1-phosphateHMDB01586439165C0010323Cyclic AMPCyclic AMPHMDB000586076C0057524CreatineCreatineHMDB00064586C0030025citric acidCitric acidHMDB00094311C0015826CitrateCitric acidHMDB00094311C00158276-phosphogluconate6-Phosphogluconic acidHMDB0131691493C00345282-oxoglutarateOxoglutaric acidHMDB0020851C0002629N-methyl-4-pyridone-3-carboxamideN1-Methyl-4-pyridone-3-carboxam-ideHMDB06807440753C0566830N-methyl-2-pyridone-5-carboxamideN1-Methyl-2-pyridone-5-carboxam-ideHMDB0419369698C05842
2.4 代谢产物路径分析 用MetPA分析的生物代谢通路显示，30个代谢产物主要参与了29条代谢路径(见表3、图1)。通过通路拓扑分析计算其影响值，选出了影响值最高的3条代谢通路作为大鼠心肌梗死过程代谢通路，分别是：柠檬酸循环[TCA循环，Citrate cycle (TCA cycle)]；丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢(alanine aspartate and glutamate metabolism)；精氨酸和脯氨酸代谢(arginine and proline metabolism)。详见图2～图4。
表3 通过MetPA 得到的独特的通路分析结果
序号 通路名称Total CmpdHitsRaw PFDRImpact1Citrate cycle (TCA cycle) 20 4 4.29E-04 3.48E-02 0.15 2Aminoacyl-tRNA biosynthesis67 5 7.63E-03 2.66E-01 0.00 3Alanine,aspartate and glutamate metabolism24 3 9.85E-03 2.66E-01 0.06 4Arginine and proline metabolism 44 3 4.99E-02 6.87E-01 0.08 5Butanoate metabolism20 2 5.48E-02 6.87E-01 0.00 6Propanoate metabolism20 2 5.48E-02 6.87E-01 0.08 7Glycolysis or Gluconeogenesis 26 2 8.74E-02 6.87E-01 0.00 8Glutathione metabolism26 2 8.74E-02 6.87E-01 0.37 9D-Glutamine and D-glutamate metabolism5 1 9.28E-02 6.87E-01 0.00 10Linoleic acid metabolism5 1 9.28E-02 6.87E-01 0.00 11Porphyrin and chlorophyll metabolism 27 2 9.33E-02 6.87E-01 0.00 12Cyanoamino acid metabolism6 1 1.10E-01 7.45E-01 0.00 13Glycine,serine and threonine metabolism 32 2 1.24E-01 7.75E-01 0.29 14alpha-Linolenic acid metabolism 9 1 1.61E-01 8.15E-01 0.00 15Methane metabolism9 1 1.61E-01 8.15E-01 0.00 16Nitrogen metabolism9 1 1.61E-01 8.15E-01 0.00 17Tryptophan metabolism41 2 1.85E-01 8.69E-01 0.20 18Valine,leucine and isoleucine biosynthesis11 1 1.93E-01 8.69E-01 0.33 19Nicotinate and nicotinamide metabolism 13 1 2.24E-01 9.56E-01 0.00 20Pentose and glucuronate interconversions 14 1 2.39E-01 9.69E-01 0.00 21Selenoamino acid metabolism 15 1 2.54E-01 9.80E-01 0.00 22Glyoxylate and dicarboxylate metabolism16 1 2.69E-01 9.89E-01 0.30 23Pentose phosphate pathway19 1 3.11E-01 1.00E+00 0.00 24 beta-Alanine metabolism19 1 3.11E-01 1.00E+00 0.04 25Pyruvate metabolism22 1 3.50E-01 1.00E+00 0.00 26Starch and sucrose metabolism23 1 3.63E-01 1.00E+00 0.17 27Purine metabolism68 2 3.80E-01 1.00E+00 0.00 28Galactose metabolism 26 1 4.00E-01 1.00E+00 0.08 29Glycerophospholipid metabolism 30 1 4.45E-01 1.00E+00 0.14 注:Total Cmpd为通路中化合物的总数;Hits是上传的标志物数据中精确的匹配的个数;Raw P为通过通路分析得出的原始P值;Impact是通过拓扑分析得出的通路影响值;FDR为错误引发率。
横坐标Pathway impact 表征由拓扑分析计算所得代谢通路的重要性值，纵坐标-logP 表示代谢通路富集分析的显著性水平。代谢通路的Pathway impact 与-logP 值越大，不同组间代谢差异的相关性越高，图中的圆圈就越大。
图1 通过MetPA得到的通路分析概要图
图中所示为KEGG ID，红色背景化合物是本研究结果中的化合物。
图2 大鼠心肌梗死模型 Citrate_cycle(TCA_cycle)代谢通路的模式图
图中所示为KEGG ID，红色背景化合物是本研究结果中的化合物。
图3 大鼠心肌梗死模型Alanine_aspartate_and_glutamate_metabolism代谢通路的模式图
图中所示为KEGG ID，红色背景化合物是本研究结果中的化合物。
图4 大鼠心肌梗死模型Arginine and proline metabolism代谢通路的模式图
2.5 代谢产物富集分析 本研究收集的30个代谢产物按疾病分类富集，出现了72个富集集(见表4、图5)，其中有17个富集集P值小于0.05，暂未发现与本研究收集的代谢产物相关的疾病。
图中每横条代表的是对应的疾病富集热图，其位置越靠顶端，代表其P值越小；横条的长度代表富集倍数，横条越长代表富集倍数越大。
图5 急性心肌梗死代谢组学按照疾病富集分析的热图
表4 急性心肌梗死代谢组学按照疾病富集分析情况
序号 富集类别TotalExpectedHitsRaw PFDR1RATS TREATED WITH HGCL2 13 0.74 7 1.25E-06 2.18E-04 2RATS TREATED WITH HYDRAZINE9 0.51 6 1.51E-062.18E-04 3EXPOSURE TO TRI-BUTYL PHOSPHATE (TBP) 4 0.23 4 8.63E-068.34E-04 4DIFFERENCE BETWEEN NORMAL HAN-WISTAR (HW) AND SPRAGUEDAWLEY (SD) RATS 100.5758.78E-056.36E-03 5PARAQUAT POISONING 7 0.40 42.68E-04 1.55E-02 6X-LINKED CREATINETRANSPORTER DEFECT 4 0.23 36.47E-04 3.12E-0272-KETOGLUTARATE DEHYDROGENASE COMPLEX DEFICIENCY5 0.293 1.55E-036.44E-02 8METABOLITES AFFECTED BY AGE 12 0.69 4 3.09E-03 1.12E-01 9FUMARIC ACIDURIA 3 0.17 2 9.13E-03 2.21E-01 10HYDROXYPROLINEMIA | HYPERPROLINEMIA,TYPE I | HYPER-PROLINEMIA,TYPE II | IMINOGLYCINURIA 3 0.17 2 9.13E-03 2.21E-01
(续表4)
序号 富集类别TotalExpectedHitsRaw PFDR11NEWBORNS,PREMATURE INFANTS,TRANSIENT IMMATURITY OF TRANSPORT SYSTEMS OR ENZYMES 3 0.17 2 9.13E-03 2.21E-0112EXPOSURE TO TRI-PHENYL PHOSPHATE (TPP) 3 0.17 2 9.13E-03 2.21E-01 13ARTEFACTS-BACTERIAL CONTAMINATION,EXCRETION OF OR-GANIC ACIDS (ARTEFACTS) [DD]10 0.57 3 1.53E-02 3.42E-01 14PYRUVATE CARBOXYLASE DEFICIENCY 4 0.23 2 1.76E-02 3.65E-01 15HARTNUP DISEASE 12 0.69 3 2.60E-02 4.72E-01 16SCHIZOPHRENIA 21 1.20 4 2.60E-02 4.72E-01 17CANCER CACHEXIA PATIENTS 13 0.74 3 3.25E-02 5.55E-01 注:Total为疾病通路中化合物的总数。
3 讨 论
代谢组学是系统生物学重要的研究方法之一，从总体代谢物轮廓上进行病理机制研究的一种重要方法，它是利用现代的分子生物学技术和计算机信息技术相结合的一种方法[5]，代谢组学常用质朴的技术，对小分子的物质进行监测，并且能够结合以往的研究，对代谢产物的来源路径进行分析，并作出物质代谢的网络拓扑结构，是动态研究疾病机制的重要方法[6]，从而指导疾病诊断、药物开发和毒理分析研究。
本研究首先利用了MetPA网络代谢分析工具对代谢产物进行了注释，所有的产物都能够在数据库上得到注释，然后对代谢产物进行了路径分析，其中代谢产物参与的有29个代谢途径。根据通路影响值的大小，其中3条代谢路径(柠檬酸循环、丙氨酸天门冬氨酸和谷氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢)有较高的通路影响值。
柠檬酸循环是人体进行有氧产生能量的基本环节，是将乙酰CoA中的乙酰基氧化成二氧化碳和还原当量的酶促反应的循环系统。本研究中有4个代谢产物(α-酮戊二酸、柠檬酸、草酰琥珀酸盐、乳清酸)参与了此通路。由于柠檬酸循环是人体最基本的能量代谢的途径，是有氧氧化的基本途径，也是糖、脂肪和蛋白质分解的共同通路和最终途径，本研究结果显示大鼠心肌梗死尿液中的4种代谢产物参与了这个非常关键的代谢途径，而整个代谢途径中的代谢产物主要有32种，体现在整个心肌梗死的病理生理过程中基本能量代谢的影响，由于心肌的缺血缺氧刺激了能量代谢的过程，促使三羧酸循环加强，以补充缺血缺氧心肌代谢的需求[7]。
最后2条通路均为氨基酸代谢通路，包含丙氨酸天门冬氨酸和谷氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢，这些氨基酸的合成障碍意味着将影响细胞内蛋白质的合成与代谢，最终导致心肌凋亡及坏死。
综上所述，发现大鼠心肌梗死模型发病机制包含了多个层面，涉及糖类、脂肪、蛋白质等物质代谢及其代谢通路，说明心肌梗死是由于多种因素作用于多个环节所致。
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